2013년 미국의학유전학회(ACMG)는 임상 엑솜 및 전장유전체 검사 과정에서 발견되는 이차적 발견(secondary findings, SF)을 환자에게 제공할 것을 권고하였다. 이를 표준화하기 위해 ACMG는 보고가 권장되는 단일유전자 질환(monogenic disease entity, MDE) 목록을 제정하였으며, 현재 v3.3 기준으로 83개 유전자와 관련 94개 MDE가 포함되어 있다. 2015년 ACMG와 AMP는 서열 변이의 병원성을 평가하기 위한 ACMG/AMP 가이드라인을 발표하였다. 그러나 이후 여러 연구에서 동일한 가이드라인을 사용하더라도 검사실 간 변이 분류 결과가 일치하지 않는 문제가 확인되었다. 이 문제를 해결하기 위해 ClinGen이 질환별 기준을 개발 중이나 아직 많은 SF에 대해 세부 기준이 존재하지 않는다. 저자들은 본 연구에서 SF 질환별 최대 허용 질병 대립유전자 빈도(disease allele frequencies thresholds, DAFT)을 계산하고 BA1 및 BS1 기준을 설정하여 검사실 간 변이 분류 일치도를 향상함으로써 불필요한 변이 검토 부담을 감소시키고자 하였다.

이를 위해 이미 ClinGen Variant Curation Expert Panels (VCEP)가 존재하는 질환은 해당 위원회의 BA1 및 BS1 기준을 사용하였다. 기준이 아직 공개되지 않았지만 개발 중인 경우에는 각 VCEP와 직접 협의하여 예비값을 제공받았다. VCEP 기준이 없는 58개 SF 질환에 대해서는 질환 유병률(prevalence), 유전자 기여도(gene contribution), 침투도(penetrance)를 고려하여 DAFT를 계산하였다. 상염색체 우성 질환은 다음 공식을 사용하였고,

상염색체 열성 질환은 다음 공식을 사용하였으며,

X-연관 열성 질환은 다음 공식을 사용하였다.

한 유전자가 여러 SF 질환과 관련되는 경우에는 유전자형-표현형 상관관계가 명확하면 각 질환별 DAFT를 계산하고 가장 높은 값을 사용하였고(예, SCN5A loss-of-function의 Brugada syndrome, SCN5A gain-of-function의 Long QT syndrome 등) 상관관계가 명확하지 않으면 각 질환의 DAFT를 계산한 후 합산하였다. BA1 및 BS1 설정은 보수적으로 BS1는 DAFT, BA1은 DAFT의 10배 값을 사용하여 병원성 변이가 실수로 benign으로 분류되는 위험을 최소화하고자 하였다. 이렇게 구한 BA1/BS1을 검증하기 위하여 gnomAD v4.1 continental group maximum (Grpmax) filtering allele frequencies (FAF)에서 가장 흔한 P/LP 값과 비교하였다.

총 28개의 SF 관련 MDE는 이미 ClinGen VCEP에서 BA1/BS1 기준을 제공하고 있었으며, 추가로 8개 질환에 대해서는 VCEP가 예비 기준값을 제공하였다. BA1/BS1 기준이 없는 58개 MDE의 47개 유전자에 대해서 DAFT를 계산하고 BA1 및 BS1 값을 산정하였다. 기존 VCEP 기준과 본 연구의 계산값을 비교한 바, 대부분의 경우 본 연구에서 VCEP 기준보다 더 높은 BA1/BS1 값을 산출하였고 일부 질환에서만 연구진이 계산한 값이 더 낮았다. 일례로 KCNQ1 (Long QT syndrome)이나 TP53 (Li-Fraumeni syndrome)에서는 VCEP가 더 높은 BS1 기준을 사용하고 있었는데, 이는 더 낮은 침투도(penetrance)를 가정하여 BS1을 높게 설정하였기 때문인 것으로 생각되었다.

BA1 검증 시 P/LP 값과 비교한 검증에서는 계산된 BA1 기준을 초과하는 P/LP 변이는 없었으며, 이는 본 연구에서 제시한 BA1 기준을 적용했을 때 실제 병원성 변이를 잘못 배제할 위험은 매우 낮음을 의미한다. BS1 검증 시 8개 유전자에서 9개의 변이(9/4,305 P/LP변이, 0.2%)가 BS1 기준을 초과하였다. 따라서 이 기준은 변이 분류의 일관성을 높이고 검사실 간 불일치를 줄이는 데 유용할 것으로 판단되었다.

ACMG/AMP 2015 가이드라인에서는 변이의 빈도가 5%를 초과하면 BA1(stand-alone benign)을 적용할 수 있도록 하였다. 그러나 이후 연구에서 일부 병원성 변이가 특정 인구집단에서 5% 이상의 빈도를 가질 수 있음이 밝혀져 BA1 적용 시 주의가 필요하다는 문제가 제기되었다. 만약 BA1 기준이 너무 낮게 설정되면 실제로는 병원성일 수 있는 변이가 추가 검토 없이 양성으로 필터링될 수 있으며, BA1 기준이 너무 높으면 양성인 변이들까지 검토하게 되어 검사실의 업무 부담이 증가한다. 따라서 질환별 DAFT를 이용한 BA1 설정은 병원성 변이 필터링과 분석 업무 감소라는 두 가지 목표를 동시에 달성할 수 있게끔 해야 하였다.

본 연구에서 모든 P/LP 변이가 BA1로 걸러졌으며, 병원성 변이를 잘못 분류할 위험은 매우 낮은 것으로 판단되었다. 본 연구에서 계산한 BS1을 적용했을 때 4305개의 P/LP 또는 pLoF 변이 중 9개만 BS1을 초과하였는데, 이는 0.2%의 비율이며, 상당히 안전한 BS1기준이라고 할 만하다. 다만 이번 연구는 동일 질환을 유발하는 다양한 병원성 변이들을 모두 고려하지는 못하였으며, 향후 VCEP가 세부 기준을 만들 때는 이를 고려해야 할 것이다.

컨센서스가 없는 SF 유전자 변이에 대해서 BS1=DAFT, BA1=10×DAFT라는 빈도 기준을 적용함으로써 검사실 간 일치도를 향상시키고 변이 분류의 정확성 제고도 꾀해볼 수 있겠다.